微生物组研究中稀释曲线的评估与 QIIME2 实操教程
稀释曲线（Curve），也称为稀薄曲线，一般用于微生物组研究中，用来评估测序体积或样本体积的饱和度。使用dada2去噪得到的表文件计算随机选择n个reads时出现的ASV数量（n小于测量的read序列总数），然后基于一组n个值（一般是一个算术序列的集合小于序列总数）绘制一条与 ASV 数量相对应的曲线。映射所需的数据包括每个样本ASV的特征表和样本元数据。关注“环境微量分析”公众号，后台回复“稀释曲线”即可获取样本数据。
1. 实际操作
（1）打开并执行挂载共享文件夹的命令；
<p><pre> sudo mount -t vboxsf qiimeshare share</pre></p>
（2）使用qiime alpha可视化工具绘制稀释曲线，探索alpha多样性与采样深度的关系。执行命令并查看帮助文档；
<p><pre> qiime diversity alpha-rarefaction --help</pre></p>
2.帮助文档分析
使用说明：qiime alpha-
通过计算“”和“”之间的稀疏度，生成α稀疏曲线。计算的中间深度的数量由“steps”参数控制，每个稀疏深度计算n''，即迭代n次。如果提供了样本元数据，样本还可以根据元数据列中的不同值进行分组。
输入文件：
--i-table 计算稀释曲线的特性表（需要文件）
--i- 使用align-to-tree-mafft-系统发育指标生成的根树文件（可选文件）
范围：
--p-max-depth 最大稀疏深度大于最小深度，从1开始（必选参数）；
--p- 计算多样性指数，可以选择''、''、''、'ace'、''、''、'chao1'、''等，更多请参见上图。如果不定义该参数，则默认计算总和，如果输入树文件则可以计算总和（可选参数）；
--m--file 元数据文件（可选参数）；
--p-min-depth 最小稀疏深度，默认为1（可选参数）；
--p-steps 最小深度和最大深度之间的稀疏深度数，从2开始，默认为10（可选参数）；
--p- 计算每个稀疏步骤的迭代次数。数量越多，计算量就越大。默认为10（可选参数）；
输出文件：
--o- 名称（必填参数）
其他选项：
---dir 输出文件路径（可选参数）
三、实战操作总结
https://p3-pc-sign.douyinpic.com/tos-cn-i-dy/170d22b455d3436f9fbe75c59f2cb195~tplv-dy-aweme-images:q75.webp?biz_tag=aweme_images&from=327834062&s=PackSourceEnum_SEO&sc=image&se=false&x-expires=1722981600&x-signature=6G6J4DXCUQuMmkwGj83FXcZC8iU%3D
AlphaCurve 计算每个采样深度的Alpha多样性指数，范围在最小采样深度--p-min-深度和最大采样深度--p-max-深度提供的值之间。每个采样深度生成10个采样表，计算表中所有样本的alpha多样性指数（即迭代次数为10，每个采样深度计算的稀疏表，由--p-控制）。为每个采样深度的每个样本绘制平均多样性值，如果提供了样本元数据--m--file参数，还可以根据元数据对样本进行分组。
4、运行分析
使用 qiime alpha 对不同深度（--p-min-深度和 --p-max-深度之间）的 ASV 表进行 alpha 子采样，并使用两个默认指标 (--p -) 的总和计算 alpha 多样性。在每个采样深度，默认计算 10 个稀疏表以提供误差估计 (--p-)。
执行命令：
<p><pre> time qiime diversity alpha-rarefaction \ --i-table dada2-table-paired.qza \ --m-metadata-file sample-metadata.tsv \ --p-max-depth 18000 \ --o-visualization alpha-rarefaction-curves-1.qzv</pre></p>
稀疏化分为两步：首先，从特征表中过滤掉稀疏深度以下的样本；然后，对所有剩余样本进行无放回采样，以达到指定的测序深度。
无需更换即可提取
不放回抽取意味着每个被抽取的个体都不会被放回种群中。下次提取个体时，总数会比上一次少一个。每次提取的概率都会变化。每次不进行放回的提取被视为一个事件，它们不是相互独立的。例如，无放回提取事件“一一提取n个序列无放回”的概率等于“一次取出任意n个序列”的概率。
稀疏深度
最大稀疏深度的值应根据dada2-table-.qzv 文件中提供的“每个样本的测序体积”信息来确定。
一般来说，选择中位数附近的值似乎效果很好。如果生成的稀疏图中的线条看起来不平坦，则可以增加此值；如果由于大于最大采样深度而丢失许多样本，则可以减少此值。通过不断调整，最终确定一个合适的值。因此，我们首先选择18000来尝试。
输出结果：
阿尔法---1.qzv |稀疏曲线结果的可视化
5、结果分析
①首先选择as，样本元数据列是place（不分组）。查看结果如下图：
图表解读：
稀疏图主要用于确定样品的丰度是否已被充分观察或测序。如果图中的线在沿 x 轴的特定采样深度处看起来“平坦”（即斜率接近于零），则这表明收集超出该采样深度的附加序列不太可能观察到新特征。如果图中的线条不平坦，这可能是因为尚未完全观察到样本的丰富度（由于测序的序列太少），或者可能是数据中仍然存在许多测序错误（错误地作为新的多样性）。
从该数据得到的稀疏曲线如上所示。一条曲线相对较短，因为 18000 超过了其采样深度 17375 ()。当序列深度达到10000时，曲线趋于平行，说明10000测序深度时的采样数量合理，可以保证大部分特征被观察到，样本α多样性指数达到稳定。
② 将样本元数据栏调整为分组以供查看。我们一共9个样本，分成3组，每组3个样本，发现TS组的指数在16000之后就趋平然后突然上升。如下图：
图表解释：当按元数据对样本进行分组时，该可视化底部的图非常重要。它说明了当特征表细化到每个采样深度时，每组中剩余的样本数量。如果给定的采样深度d大于样本s的总频率（样本s获得的序列数），则无法计算样本s在采样深度d处的多样性。顶部绘图将不可靠，因为它将基于相对较少的样本进行计算。因此，在按元数据对样本进行分组时，必须查看底部图表以确定顶部图表中显示的数据是否可靠。
我们设置的采样深度是18000，比最小深度17375()还要大，所以在16000之后TS样本数量突然变成2，观察到的特征数量突然变大。调整参数并再次运行分析。
③增大步长，选择共同的多样性指数，重新绘制曲线。执行命令：
<p><pre> time qiime diversity alpha-rarefaction \ --i-table dada2-table-paired.qza \ --m-metadata-file sample-metadata.tsv \ --p-metrics 'shannon' 'simpson' 'observed_features' 'chao1' 'goods_coverage' \ --p-max-depth 10000 \ --p-steps 25 \ --o-visualization alpha-rarefaction-curves-2.qzv</pre></p>
https://www.shxianghu.com/attachments/2019/07/156395710777720ddab824bf25.jpg
输出结果：
阿尔法---2.qzv |稀疏曲线结果的可视化
qzv解压后的结果如下图：
6. 问题与解答
① 有人可能要问，为什么不直接选择参数并设置步长呢？
我们可以看到，使用默认参数的第一次运行花费了31秒，增加步长并选择多个多样性指数后花费了31秒。因此，我们在使用默认参数进行分析时，可以花更少的时间尝试不同的采样深度，并确定最终确定合适的参数，然后进行深入分析。
② 为什么要加大步长再运行一次？
根据小编的经验，可视化图表可能无法直接在文章中使用，所以需要根据稀释曲线的数据结果在其他软件中重新绘制。但默认10个区间的采样结果有时并不能保证曲线平滑，因此可以增加区间数。 。此外，还可以增加样本数量。
7. 用于绘制稀释曲线
根据.csv 文件的数据内容绘制曲线。
（1）使用excel打开数据，如下图：
（2）选择任意单元格>按Ctrl+A全选内容>复制内容>转置粘贴>整理成如下格式；
（3）计算每个样本在每个采样深度iter1-10的平均值，添加新的工作表并整理成如下格式，保存为xlsx类型文件；
(4)打开并导入数据。数据>从文件导入>Excel>选择文件>调整导入；
（5）按住Ctrl+A，选择所有数据>绘图>基本2D>样条线；
(6)对图形进行调整和美化，如下图：
8. 总结——为什么需要进行稀释曲线分析？
微生物组样本的测序深度与群落中的原始生物量没有直接关系，但相对测序深度对观察到的群落有很大影响。因此，对于大多数多样性测量，必须对数据进行归一化，以解决样本之间不均匀的测序深度。目前最好的方法是使用稀疏的，通过二次采样进行归一化。
Alpha多样性是通过扁平化来计算的（扁平化可以使数据标准化），但是扁平化有一定概率（小概率）会评估出错误的α多样性结果。因此，现在通过多次平滑来计算α多样性，并通过平均来校正α多样性，这体现了每个采样深度迭代10次的重要性。
稀释曲线补充了各个 α 多样性结果，允许对不同梯度的结果进行综合分析和呈现。基于不同深度或样本量水平展示α多样性更有利于微生物群落多样性的综合评估。
提示：如果熟悉几种常见的α多样性指数的计算公式，你会发现α多样性指数与观测到的OTU数量有关。
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