四环素提取纯化方法：一种生物与新医药技术领域的创新
本发明属于生物及新医药领域技术领域：
特别是涉及一种四环素的提取纯化方法。
背景技术：
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：四环素（，er）是四环类抗生素的一种，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、病毒性病毒、螺旋体甚至原虫有良好的抑制作用，对结核杆菌、变形菌等无效。 。其作用机制是在与核糖体的30s亚基结合后阻止氨酰tRNA与核糖体结合。现有技术中，四环素的发酵采用金黄色葡萄球菌为发酵菌株，采用两阶段发酵方式。四环素的提取纯化可采用以下两种方法：一是将四环素发酵液稀释，然后用草酸酸化一次；二是将四环素发酵液稀释后用草酸酸化一次。纯化，然后板框或膜过滤，调节pH结晶沉淀，即得四环素碱成品；二是发酵稀释四环素，然后用草酸酸化，过滤，调节pH，加入氯化钙形成钙盐沉淀，然后用草酸溶解。然后调节pH使粗碱沉淀，溶解于草酸水中，用活性炭脱色，调节pH即得四环素碱成品。目前，国内四环素生产企业通常采用第一种方法来提取和纯化四环素。该方法存在以下问题： 1、四环素发酵液采用一次性酸化。酸化液存放时间长，易产生四环素等杂质； 2..在纯化过程中，四环素和杂质的浓度相对较高。添加的纯化剂在去除杂质的同时对四环素有吸附和包封作用，导致过滤过程中很难用酸性水洗掉这部分四环素； 3、加入较多的纯化剂会使整个发酵液变稠，纯化效果减弱，影响滤液的质量，进而影响过滤效率，最终影响四环素提取的质量和收率。
技术实现要点： 本发明的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种能够有效提高四环素成品含量和收率、降低生产成本的四环素提取纯化方法。本发明实现上述目的所采用的技术方案是：一种四环素的提取纯化方法，其特征在于，其工艺步骤为：先将四环素发酵液用水稀释，冷却，继续酸化，然后用陶瓷膜分离，得到过滤液。每隔5～10分钟依次加入黄血盐和硫酸锌，搅拌反应，然后板框过滤、碱结晶，最后过滤、脱水、干燥，即得四环素成品。四环素用水稀释时，加水量为发酵液体积的0.5～2.0倍。冷却连续酸化是指将稀释后的四环素发酵液冷却至10-20℃，然后加入草酸，控制发酵液pH至1.5-2.0，酸化5-10分钟。陶瓷膜的孔径为50-100nm。陶瓷膜分离时，当四环素发酵液浓缩1.5-2倍时，加入草酸水进行洗脱。洗脱过程温度控制在10-20℃，直至达到四环素残留单位。当滴度≤1000μg/ml时停止。黄血盐和硫酸锌均需热熔添加，添加量控制在50-80g/亿。与现有技术相比，本发明具有以下技术优点： 1、本发明首先对四环素发酵液进行稀释，并在连续酸化过程中对四环素发酵液进行酸化。该过程通过控制酸化时间、温度和pH来缩短酸化液的储存时间，从而避免四环素的降解和破坏，提高产品收率。
2、现有工艺在膜过滤前添加净化剂。在纯化过程中，四环素和杂质的浓度相对较高。添加的纯化剂不仅去除杂质，而且吸附并包封四环素。因此，在过滤过程中，很难用酸性水洗掉这部分四环素；而且净化剂的添加量较大，不仅使整个发酵液变稠，削弱净化效果，影响滤液的质量，也影响过滤效率。 ，最终会影响四环素提取的质量和收率。本发明采用膜过滤进行净化处理。由于膜过滤精度高，杂质截留效果好，滤液中四环素浓度降低，杂质含量低。因此，增加的净化剂量自然会减少，混合效果更好，配合持续。酸化后，产品质量大大提高。综上所述，本发明的方法不仅显着提高了四环素的质量，而且四环素收率提高了3％～5％，同时减少了纯化剂的使用量，提高了膜运行效率，降低了生产成本。附图说明图1是本发明的四环素的提取和纯化的工艺流程图。具体实施方式下面通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明。应当理解，提供实施例是为了说明本发明而不是限制本发明。本发明的范围和核心内容由权利要求书确定。以下实施例中的四环素发酵液是使用目前公开的发酵方法制备的。例如，采用金黄色链霉菌作为发酵菌株，采用二次发酵方式对发酵液进行发酵。具体流程为：金黄色葡萄球菌生产菌株（沙土管）在母瓶斜面培养孢子后，得到母瓶斜面孢子，然后在子瓶斜面培养孢子瓶得到子瓶的斜面孢子，然后在种子罐中培养，得到种子培养液，然后在发酵罐中培养，得到发酵液 液体。
实施例1 取四环素发酵液20L，测定效价单位为30852μg/ml，加水10L一次稀释，搅拌混合均匀，冷却至17℃，将稀释后的发酵液倒入物料混合器中，同时加入草酸，控制发酵液pH为1.5～2.0，控制酸化时间为5～10分钟，采用陶瓷膜孔径100nm，在线连续酸化释放分离。当浓缩至1.5倍时，开始加入pH为1.72的草酸水进行洗脱。洗脱过程温度控制在10-20℃，洗脱水量80l。洗脱结束，滤液总量为97l，平均效价单位为8270μg/ml，十亿分之0.8（生产中常用活性成分，十亿以109u计算）。加入40g黄血盐(热溶)，搅拌5分钟，再加入40g硫酸锌(热溶)，搅拌5分钟，用板框过滤分离，得到纯化液。控制温度5～10℃，加入浓度15～20%，用液碱调节pH至4.6～4.8，搅拌、过滤、漂洗、脱水、干燥，即得四环素成品。实施例2 取四环素发酵液25L，测定效价单位为31200μg/ml，加水12.5L一次稀释，搅拌混合均匀，冷却至16℃，将稀释后的发酵液倒入物料混合机中，同时通入草酸，控制发酵液pH至1.5-2.0，搅拌时间控制在5-10分钟，陶瓷膜采用100nm孔径，在线连续酸化、释放分离。浓缩至1.6倍时，加入pH为1.75的草酸水洗脱。工艺温度控制在10-20℃，洗脱水量100l。洗脱结束，滤液总量为121.9l，平均效价单位为8318μg/ml，10亿，加入60g黄血盐（热溶），搅拌5分钟，然后加入60g硫酸锌（热溶）融化），搅拌5分钟，板框过滤分离，得到纯化液，控制温度5-10℃，加入15-20%液体用烧碱调节pH 4.6-4.8，搅拌，过滤，漂洗，脱水，干燥，即得四环素成品。
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实施例3 取四环素发酵液30L，测定效价单位为30085μg/ml，加水15L一次稀释，搅拌混合均匀，冷却至17℃，将稀释后的发酵液倒入物料混合器中，同时加入草酸控制发酵液pH至1.5~2.0，控制搅拌时间5-10分钟，进入带孔的陶瓷膜直径100nm，在线连续酸化释放分离。当浓缩至1.7倍时，开始加入pH 1.78的草酸水进行洗脱。洗脱过程温度控制在10~20℃，洗脱水量120l。洗脱结束，滤液总量为147.4L，平均滴度单位为7960μg/ml，十亿分之1.17，加入93.6g黄血盐（热溶），搅拌5分钟，然后加入93.6g锌硫酸盐（热熔），搅拌5分钟，板框过滤分离，得纯化液，控制温度5-10℃，加入用15-20%液碱调节pH至4.6-4.8，搅拌，过滤，漂洗，脱水，干燥，即得四环素成品。对比例：取四环素发酵液30L，测定效价单位为30030μg/ml，加水15L一次稀释，搅拌混合均匀，冷却至17℃，加入草酸调节发酵液pH至1.8，搅拌30分钟，每隔10分钟加入一次。使用孔径为 100 nm 的陶瓷膜分离黄血盐、硫酸锌和硼砂（在均匀的热溶液中添加）。温度控制在5至10℃。加入浓度15～20%的液碱调节pH至4.6～4.8，搅拌，过滤。水洗、脱水、干燥即得四环素成品。
图1：本发明与对比例质量对比4-灰分含量实施例13.594.500.060.19实施例23.494.200.050.25实施例33..110.20对比例4.791.300.130.22质量标准≤5.088.0~102≤0.5图中≤1.0≤0.5 1、4-etc是指4-表莫四环素，atc是指脱水四环素，4-eatc是指脱水4-表莫四环素，是四环素的降解产物(杂质)。 tc是指四环素（活性成分）的含量。通常，质量改进主要是指有效成分含量的增加和有关物质（杂质）含量的减少。从图1可以看出，实施例1、2、3中与对比例相比，4-etc、atc都有不同程度的降低，而tc值则明显增大。充分说明通过本实验工艺的改进，四环素的质量得到了提高。当前页 1 1 2 3
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