微生物检方法验证方法的相关探讨与湖州药检所王新财的研究

aizixun8

微生物检验方法验证 方法验证 湖州药品检验所 王新才 1.微生物检验方法验证 1.细菌霉菌和酵母菌计数方法验证 1.1 验证目的：保证试验方法的完整性和试验结果的可靠性。 1.2 需要验证时：建立微生物检验方法时。 b.当药品成分或原检测条件发生变化时。 1.3 验证菌株（1）大肠杆菌（）【CMCC（B）44102】； (2)金黄色葡萄球菌()[CMCC(B)26003]； (3)枯草芽孢杆菌()[CMCC(B))63501]； (4)白色念珠菌()[CMCC(F)98001]； （5）黑曲霉（ niger）[CMCC（F）98003]；）（2）（3）这5种菌株具有普遍的代表性，这5种细菌代表不同类别的微生物，（1）真菌，（5）霉菌。用于验证的标准菌株的传代数不得超过5代。属于省内的菌种，（4提供的是第二代，我提供的是第三代。 1.4菌液制备 1.4.1制备大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物少许，接种到营养液中肉汤培养基，32.5℃2.5℃培养18-24小时；新鲜培养的白色念珠菌在改良马丁氏培养基中，25.5℃2.5℃培养24-48小时；上述培养物用0.9%无菌氯钠溶液处理。逐级稀释，配制成50μg/ml的菌悬液。

将黑曲霉新鲜培养物接种于改良马丁培养基斜面，25.5℃～2.5℃培养5～7天，成熟大量孢子。添加3-5ml 0.9%无菌氯化钠溶液以洗脱孢子。用细菌纱布或薄棉过滤，逐渐将菌悬液稀释至50~/ml。 1.4.2 注：在制备菌悬液的稀释过程中，每个稀释度都必须充分混合并摇匀。 b.由于菌株是具有特殊活性的生物体，菌株的状态、接种量和培养时间对最终菌悬液制备浓度有很大影响。因此，试验过程中应严格遵循确定的实验参数（接种量）。 、培养温度、培养时间、培养基量）。 c.配制好的原菌悬液应当天使用。若超过一周，应重新计算。 d.保护自己并防止感染。 1.5 方法 1.5.1 采用平板法验证无明显抗菌作用的水溶性制剂的微生物限度检查方法。方法验证的主要思想：细菌添加和回收。试验组：取试验可能的最低稀释倍数的试验液1ml和浓度为50μ/ml的菌液1ml，分别注入平板中。立即倒入琼脂培养基。为每种测试细菌准备 2 个平板并进行培养。数数。 ?菌液组：确定加入的试验菌数量，即将上述菌液1ml注入培养皿中，倒入琼脂培养基，每个试验菌准备2个培养皿，培养并计数。受试品对照组：测定受试品背景菌数，即加入上述供试液1ml，倒入琼脂培养基，培养，计数。

验证试验应至少进行3次独立的平行试验，对每种细菌进​​行一一验证，并分别计算每种试验细菌的回收率。试验组平均菌落数-受试品对照组平均菌落数。试验组细菌回收率%=用产品制备方法和计数方法测定受试产品中细菌、霉菌和酵母菌的数量。如果任何一项试验中试验组的细菌低于70%，则应采用其他方法重新验证。 1.5.2 对于具有轻微抗菌作用的水溶性制剂，可采用培养基稀释法进行方法验证（上述常规平板法检测细菌的回收率小于70%）。 ?测试组：a．准备25个平板，分为5组，每组5个平板，并标记每个对应的菌株。 b.取试验中可能使用的最低稀释倍数供试品溶液0.2ml，分别注入上述板中，即每组加供试品溶液1ml。 c.按刻度注入浓度为50%/ml的菌液1ml，立即倒入琼脂培养基，培养，计数，取平均值。 【菌液组：确定试验菌添加数，同1.5.1】。受试品对照组：测定受试品背景菌数，即取上述供试品溶液1ml分成5等份，倒入5个平皿中，倒入琼脂培养基，培养，计数。试验组细菌回收率的计算与平板法相同。注：上述培养基稀释方法是将1ml测试液稀释5倍培养。也可采用2倍稀释或10倍稀释培养，即每皿中加入0.5ml或0.1ml测试液。

1.5.3 膜过滤法一般适用于可溶性抑菌制剂。主要思想：过滤掉抗菌成分，添加细菌进行回收。试验组：取规定量试验中可能使用的最低稀释倍数试验液，过滤，用稀释液冲洗数次，最后一次冲洗时加入50~/ml试验菌1ml，过滤，按膜过滤法计数。 【菌液组：测定添加的试验菌数，同1.5.1】，不需过滤。试验样品对照组：取规定量试验中可能使用的最低稀释倍数试验液，过滤，用稀释液冲洗数次，按膜过滤法计数。稀释对照组：用相应的稀释液代替测试样品，加入上述菌液1ml，过滤，用稀释液冲洗数次，按膜过滤法计数。试验组细菌回收率与1.5.1平板法相同。稀释液对照组平均菌落数小于70%，本方法可行，根据本制备方法和计数方法可以确定测试样品中细菌、霉菌和酵母菌的数量。注：a.供试品的用量一般为每片滤膜1g或1ml。 b.稀释液冲洗的次数和体积应根据试验产品的性质和实际情况确定。冲水次数一般不少于3次，总冲水量一般不大于1次。个人认为少量多次比较好。 c.稀释剂对照组考察的是供试品溶液制备和处理过程中微生物的影响程度，因此添加的试验菌应参与整个制备和处理过程。

d.选择合适的过滤膜。 e.所有与测试样品或稀释液直接接触的器具均应消毒，以防止操作过程中污染滤膜。 1.5.4离心沉降集菌法的主要思想是：离心沉降和离心集菌。试验组：将试验液离心，加入细菌，用适当的方法进行计数。菌液组：确定添加的试验菌数量。供试液组：将供试液离心，同法计数。稀释液对照组：用稀释液代替测试样品，加入细菌（菌液参与离心）。处理过程与测试溶液组相同。各细菌试验组的细菌回收率及稀释液的细菌回收率均不低于70%。 1.5.5 中和法主要思想：在配制供试品溶液时，加入适当的钝化剂、酶等中和剂，以消除或降低制剂的抗菌性能。中和剂的用量应通过多次试验确定。稀释剂对照组考察中和剂本身的抑菌性能以及处理过程对微生物的影响。各细菌试验组的细菌回收率和稀释液对照组的细菌回收率均不低于70%。 1.6 讨论如果测试样品需要分散、乳化等特殊处理，则应考察处理过程对微生物检测的影响，即考察稀释液对照组的回收率。 b.有时单一方法不能消除测试样品的回收率，可以多种方法联合使用。 c.验证方法应进行至少三个独立的并行测试。这是对验证方法本身的重复性的检验。 d.验证测试可以与测试产品上的细菌、霉菌和酵母菌计数同时进行。 e.国内外验证菌株对比如下： CP BP USP JP 各国药典菌株 大肠杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色芽孢杆菌 白色念珠菌 枯草芽孢杆菌 沙门氏菌 白色念珠菌 枯草芽孢杆菌 念珠菌比坎人黑曲霉 50~100 100 105-106 103 添加菌量（cfu） 测试方法 中和法 中和法 中和法 平板法 平板法 平板法 平板法 稀释法 稀释法 稀释法 稀释法 平板表面包被法 离心沉淀法 膜过滤法膜过滤法 膜过滤法 膜过滤法 2 控制菌验证 2.1 验证目的同1.1。

何时需要验证同1.2。 2.2 验证菌株（1）大肠杆菌（coli）[CMCC(B)44102]； (2)金黄色葡萄球菌( )[CMCC(B)26003]； (3) B 型副伤寒沙门氏菌 ( ) [CMCC(B) 50094]； (4) 铜绿假单胞菌 ( )[CMCC(B) 10104]； (5) 产孢梭菌 ( )[CMCC(B) 64941]；验证时，根据每个菌种按照微生物限度标准规定的对照菌选择相应的验证菌株进行检验。验证大肠菌群试验方法时，应使用大肠杆菌作为验证菌。 2.3菌液的制备：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、B型副伤寒杆菌、铜绿假单胞菌新鲜培养物接种到营养肉汤培养基中，将生孢梭菌新鲜培养物接种到硫乙醇酸液体培养基中，32.5°培养C 至 2.5°C 18 至 24 小时。用0.9%无菌氯化钠溶液配制每1ml含10~细菌的菌悬液。 2.4 验证方法？试验组：取规定量的供试品溶液（各对照菌检查方法中规定的）和10~试验菌加入增菌培养基中，按相应的对照菌检查方法进行检查。

当采用膜过滤法时，应将测试菌液加入到最后一次冲洗液中。冲洗后取出滤膜，接种到增菌培养基中。 ？阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证控制细菌检查方法的特异性。方法与试验组相同。验证大肠杆菌、大肠菌群、沙门氏菌检查方法时，以金黄色葡萄球菌作为阴性对照；验证铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检查方法时，以大肠杆菌作为阴性对照菌。希腊细菌。结果判断：对照组未检出阴性菌。如果试验组中检出试验菌，则证明可以按照试验液配制方法和对照菌检查方法检查对照菌。若试验组中未检出试验菌，则应消除试验品种的抗菌活性。该方法与细菌、霉菌和酵母菌的验证方法相同（稀释法、膜过滤法、中和剂、沉降法），应建立新的方法。 ，重新验证。 2.5 讨论：采用膜过滤法配制供试品溶液时，稀释液冲洗的次数和体积不一定与计数法验证的相同，应以试验组检测为准。 b.阴性细菌对照组（非阴性对照）的定义和意义。 c.验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。二、无菌检验方法验证 1、验证目的：检验方法的完整性和结果的可靠性。验证的主要思路：供试品+测试菌为阳性。 2. 细菌种类 (1) 金黄色葡萄球菌 ( ) [CMCC (B) 26003]； (2) 铜绿假单胞菌 ( ) [CMCC (B) 10104]； (3)枯草芽孢杆菌( )[CMCC(B)63501]； (4) 产孢梭菌 ( )[CMCC(B) 64941] (5) 白色念珠菌 ( )[CMCC(F) 98001]； (6) 黑曲霉 (niger) [CMCC(F) 98003]； 3、菌液配制如上，最后逐级稀释至小于/ml的菌悬液。

4 验证方法 4.1 膜过滤法试验组：按膜过滤法过滤规定量的测试样品，冲洗，最后一次冲洗时加入少于10%的测试菌，过滤，加入培养基进行培养。文化。菌液组：取等体积培养基，加入试验菌，培养。试验菌按同样方法操作，在规定温度下培养3～5天。结果判断：试验组和菌液组均生长良好，可按本检验方法和检验条件进行受试品的无菌检验。如果试验组中的微生物生长弱、缓慢或根本不生长，则说明试验产品在试验条件下具有抗菌作用。处理方法：增加冲洗量、冲洗次数或改变冲洗液种类。 ?增加培养基用量。 ?添加中和剂或灭活剂。 ?更换过滤膜类型。消除抑菌作用并重新验证。 4.2直接接种法准备：巯基乙酸液体培养基8管适量，改良马丁培养基4管适量；无菌接种设备等。 注：培养基的灌装量根据供试品的性质和供应情况而定。取决于供试品的载量，详见药典。整个试验分为试验组和菌液组。方法流程如下：取12管合适的培养基，分别插入小于100%的测试菌。每个细菌连接2管菌液组。试验组6菌各1管，6菌各1管。插入指定量的测试样品并在指定温度下孵育3至5天。结果判断：试验组和菌液组均生长良好，即可按本检验方法和检验条件进行试验。