显微镜：从 1590 年到今天，探索微观世界的重要工具

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001 生物显微镜使用技巧及原理

显微镜是一种放大仪器。最早的显微镜是1590年荷兰的詹森父子制造的。现今的光学显微镜可将物体放大1600倍，最小分辨极限为波长的1/2，约0.2μm。1931年，恩斯特·鲁斯卡发明了电子显微镜，使科学家能够观察到小至百万分之一毫米的物体，从而彻底改变了生物学研究，1986年他因此荣获诺贝尔奖。

显微镜给人类的视野打开了一个全新的微观世界，人们第一次看到了数以百计的“新”微小动物和植物，以及从人体到植物纤维等一切物质的内部结构。显微镜的发展对生物学的发展起了很大的推动作用，直到今天，显微镜仍然是生物学等学科研究和学习的重要工具，学习显微镜的理论知识，掌握使用光学显微镜的方法和技巧，是中学生物学学习的重要内容。

1、光学显微镜的一般结构：

光学显微镜由目镜、物镜、粗调焦螺旋、微调焦螺旋、膜夹、通光孔、遮光罩、变倍镜、反射镜、载物台、镜臂、镜筒、镜座等组成。

这些结构主要分为三部分：机械部分、调节部分和光学部分。

1.1.机械部分主要包括：

（1）显微镜底座：显微镜的基座，用来支撑整个显微镜机身。

（2）镜柱：镜座上的直立部分，用于连接镜座与镜臂。镜柱与镜臂之间采用活动关节连接，通过活动关节可将镜柱上部向后倾斜，方便观察。

（3）镜臂：一端连接镜柱，另一端连接镜筒，是拿、放显微镜时用手握住的部件。

⑷目镜筒：连接于镜臂前端上方，上端安装目镜，下端安装物镜转换器和物镜。

⑸载物台：位于镜筒下方，有方形或圆形两种形状，用于放置玻璃载玻片标本。中央有通光孔，通光孔两侧装有载玻片夹，用以固定载玻片。载物台上装有载玻片标本推杆（载玻片推杆），推杆左侧有弹簧夹，用以夹持载玻片标本，载物台下方有推杆调节轮，可使载玻片标本作左右、前后移动。）

1.2.调整部分包括：

（1）物镜转换器：连接在镜筒底部，可自由旋转。盘上有3-4个圆孔，是安装物镜的部件。通过旋转转换器，可以换装不同倍率的物镜。当前使用的物镜对准物镜的出光孔即可。

（2）粗调焦螺旋和微调焦螺旋：这是装在镜臂上的两个一大一小的旋钮，调节时带动镜筒或载物台上下移动，以调节载玻片标本与物镜的距离，使物体像清晰。粗调焦螺旋上下移动很快，幅度大，微调焦螺旋上下移动缓慢，幅度小（细微）。多用于使用高倍物镜时，以获得较清晰的图像。用以观察标本不同层次、不同深度的结构。

（3）反射镜、遮光罩、光圈：调节光照强度的部件。

反射镜：安装在镜臂下方，可任意方向旋转。有平面和凹面两面，其作用是将光源发出的光线经快门的光圈反射，再通过光孔照射到标本上。凹面镜使光线聚焦，聚焦作用强，适合光线较弱时使用。平面镜无聚焦作用，适合光线较强时使用。

遮光罩及光圈：载物台底部装有一块可旋转的带有不同大小孔（光圈）的圆板，旋转遮光罩时，可使不同大小的孔（光圈）对准通光孔，从而调节进入通光孔的光线强度。较先进的显微镜的快门类似于照相机的快门，是由围绕中央通光孔（光圈）螺旋排列的金属片（起遮光作用）所构成，侧面有调节旋钮，可前后推动，调节金属片的排列，使中央圆孔（光圈）的大小发生变化，从而控制进入通光孔的光线强度。

有些显微镜在反射器和载物台之间有一个聚光镜，用于聚焦光线并增强标本的照明。

1.3.光学部分主要指用于放大和成像的物镜和目镜。

（1）物镜：装在镜筒下端的转换器上，通常有3～4片长短不一的物镜。镜体上刻有若干数字，如“10/0.25”、“40/0.65”、“100/1.25”，还有一组“160/0.17”。其中“10”、“40”、“100”等代表不同的物镜放大倍数；“0.25”、“0.65”、“1.25”代表不同的物镜数值孔径；“160”为镜筒长度（mm）；“0.17”为所用盖玻片的标准厚度（mm）。上面刻有“100”的最长的镜头是油镜（中学基本不用）。另外，高倍显微镜和油镜上还常常加一圈不同颜色的线条，以示区别。

（2）目镜：装在镜筒上部，通常有2～3个目镜，上面刻有5×、10×或16×等字样，以表示放大倍数，通常安装10×目镜。存放在箱内镜盒内。

●显微镜物镜的长度与放大倍数呈正相关，而目镜的长度与放大倍数呈负相关。即物镜越长，放大倍数越高；目镜越长，放大倍数越低。

2、光学显微镜的工作原理：

光学显微镜的工作原理是使光源发出的光线照射到标本上，经透镜（物镜和目镜）折射后，在像屏（人的视网膜）上呈现标本的放大图像。其中最关键的两个环节是：标本的照明和标本的观察，这也是显微镜使用中的两个核心内容。

2.1. 照亮标本：

我们生物实验课最常用的复式光学显微镜是透射显微镜。光源→反射镜（反射）→遮光罩（光圈）→载物台通光孔→标本→物镜，光线从标本底部透射到标本进入物镜（第1页中间图片）。透射显微镜常用于观察生物组织内部结构。

透射显微镜所观察的物体（标本）必须是透明的或非常薄的，以便光线可以穿过它进入显微镜镜头并观察到放大的图像。这也是制作载玻片标本的材料要求：撕下的薄薄的表面组织制成载玻片；液体、凝胶等在玻璃载玻片上铺成薄层-涂片；厚的、内部的组织切成薄片-切片。为了更容易区分或突出组织细胞内部的某种结构，通常需要对一些透明材料进行特定的染色。

照射标本的光的强弱和制作标本的材料的透光率（受材料的大小、厚度、颜色、透明度等影响）都会影响视野内的光强，从而影响显微镜下图像的观察。低倍物镜和高倍物镜的光强不同，因此，应根据不同的标本和所用的不同物镜来调整光强。确定照射标本的光强，使观察的图像清晰即可。这种调整可以通过选择反射镜的类型、调整反射镜与光源之间的夹角、旋转快门选择不同的光圈等来实现。一般情况下，染色标本光强要强，未染色标本光弱，无色透明标本采用暗视野；用低倍物镜观察时光强要弱，用高倍物镜观察时光强要强。

2.2. 标本的放大成像：

显微镜的目镜和物镜都是凸透镜，焦距不同。物镜凸透镜的焦距小于目镜凸透镜的焦距。物镜相当于放映机的镜头，物体通过物镜后形成倒立的、放大的实像。目镜相当于普通的放大镜，实像通过目镜后形成正立的、放大的虚像。一般来说，物体通过显微镜到人眼处形成倒立的、放大的虚像（第1页右图）。

能够反映显微镜性能并影响显微镜成像的重要参数包括显微镜的放大倍数、分辨率和工作距离。

显微镜的放大倍数

放大倍数是指眼睛所见像的大小与相应标本大小之比，是指长度而非面积的比例，显微镜的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积，10×，目镜放大10倍，放大倍数10×10=100。

●显微镜分辨率

分辨率又叫分辨力，分辨力的大小是用分辨距离（能分辨出两个物体的最小距离）的数值来表示的，分辨距离越小，分辨力越强，在25cm的距离上，正常人眼可以看到相距0.073mm的两个物体点，这个0.073mm的值就是正常人眼的分辨距离。

显微镜的分辨率取决于物镜的分辨率，目镜是用来将物镜放大的像放大的，物镜无法分辨的细微结构，即使经过高倍目镜放大，也看不清楚，所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜的分辨率。

物镜的分辨距离（分辨率）是由它的数值孔径（NA）和照明光的波长决定的，当采用普通的中心照明（能使光线均匀地穿过标本的明亮照明）时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA（d为物镜的分辨距离，单位为μm；λ为照明光的波长，单位为μm；NA为物镜的数值孔径，NA=nsinθ，n为折射率，θ为孔径半角，sinθ的最大值只能达到0.95）。与物镜本身相关的是它的数值孔径，数值孔径讨论起来非常复杂，它与其他技术参数密切相关，几乎是决定和影响其他技术参数的一个参数。它与分辨率和放大倍数成正比，随着NA值的增大，视场宽度（视场）和工作距离会相应减小。简单来说，低倍物镜的NA值较小，放大倍数低，分辨率低，视场大，工作距离大；高倍物镜的NA值较大，放大倍数高，分辨率高，视场小，工作距离大。下表是（消色差）物镜的一些相关值。

放大

不适用

解析度 μm

视场

视野亮度

工作距离mm

10×

0.25

1.10

更大

更明亮

≈7.65

40×

0.65

0.42

较小

更暗

≈0.48

100×

1.25

0.22

最低限度

最黑暗

≈0.198（油浸镜头）

显微镜工作距离

工作距离是指最清晰观察标本时，物镜前透镜底部到标本盖玻片顶部的距离，物镜的工作距离与物镜的焦距有关，物镜焦距越长，放大倍数越低，工作距离越长。

如果把显微镜看作是一个简单的透镜成像系统，与成像有关的数值有三个：物距、像距和透镜的焦距，显微镜的工作距离相当于物距。而在这三个数值中，唯一重要的就是物距（工作距离）——载玻片与物镜之间的距离。通过旋转粗、微调焦螺丝，使镜筒或载物台上下移动，可以改变载玻片标本与物镜之间的距离，使图像落在人的视网膜上。

显微镜检查时，用某一放大倍数的物镜观察时成像清晰，换用另一放大倍数的物镜时，成像也应基本清晰，各像中心点基本对应，偏差不大。这是显微镜设计时要重点注意的一点。生产时要进行调焦、调轴。

共焦性是指使用不同倍率的物镜观察清晰图像时，盖玻片表面到物镜与物镜转换器连接点的距离（共焦距离）基本一致。由于不同倍率的物镜长度不同，其工作距离也不同。共焦性就是使不同倍率物镜所成图像的中心轴（点）基本重合或在很小的范围内偏离。共焦性的好坏和共焦程度是显微镜质量的重要指标。

使用高倍物镜的关键操作是：将低倍物镜下的清晰理想像移至视野中心，换用高倍物镜，调节视野亮度，微调微调旋纽，以较大的放大倍数看到更清晰的图像。其中，“微调微调旋纽”、“可见”、“像清晰”是共焦的结果（共焦大大简化了使用高倍物镜的操作）；“将低倍物镜下的清晰理想像移至视野中心”，正是“同轴”保证了高倍物镜的视野在低倍物镜的视野中心。

3.光学显微镜的使用方法：

学会正确使用光学显微镜，可以为我们观察微生物世界打开一扇窗户，是中学生物教学必备的一项重要技能。

了解显微镜的工作原理可以帮助我们学会更好的使用生物显微镜，生物显微镜的使用包括低倍显微镜和高倍显微镜的使用，这里说的低倍显微镜和高倍显微镜主要是指低倍物镜和高倍物镜。

3.1. 如何使用低倍显微镜：

（1）显微镜的取出和摆放：显微镜一般都放在柜子或盒子里，需要用的时候从柜子里取出，右手紧握显微镜臂，左手握住显微镜底座，将显微镜放在左肩前的实验桌上，距桌边约7厘米，以方便操作。

（2）调焦：用拇指和中指拨动旋转器（切勿用手移动物镜），使低倍物镜与载物台通光孔对准（转动时听到“敲击”声，说明物镜光轴已与镜筒中心对准），将光圈调节至较大，并将反射镜转向光源方向，用左眼通过目镜观察（睁开右眼），同时调整反射镜的偏转角度，直至视野内出现明亮的光点为止。

3. 放置载玻片标本：取一片载玻片标本，将其放置在载物台上，确保盖玻片的一面朝上，不要倒置。用载玻片夹将其夹住，然后将载玻片移到需要观察的标本表面。调整该部位至视野范围内。

⑷ 调整焦距：先调低，后调高，再微调。用左手顺时针（向外）旋转粗调焦旋钮，使镜筒慢慢下降，直至物镜距离标本约5毫米。不要通过目镜观察，一定要从右侧看着镜筒下降，并监视镜头与载玻片的距离，避免下降过快，损坏镜头或标本。然后，用左眼通过目镜观察（双眼要对齐）。双眼睁开，用左手逆时针（向内）缓慢旋转粗调焦旋钮，使镜筒慢慢上升，直至视野内出现物体轮廓。最后，用左手调节微调焦旋钮，在目镜上观察左眼。（对于上下移动载物台的显微镜，操作与此相反。）

⑸ 寻找理想物体：若物体不在视野中心，则移动载玻片，使要观察的部分进入视野。（注意，移动载玻片的方向与视野内物体移动的方向相反。）若不合适，可通过调整光圈大小来调整。

3.2. 高倍显微镜的使用方法：

（1）“移”——选择好目标：必须先把需要进一步观察的区域移到低倍显微镜下的中央，同时把图像调整到最清晰的程度，然后才能用高倍显微镜观察。

（2）“换”——转动转换器，更换高倍镜。换高倍镜时，要慢慢转动，并从侧面观察（防止高倍镜撞到幻灯片），如果高倍镜撞到幻灯片，说明低倍镜的焦距调节不当，应重新调节。

（3）“调焦”——调整焦距和亮度：换上高倍镜后，用左眼通过目镜观察，此时一般能看到不太清晰的图像，可将微调螺丝的旋钮逆时针旋转约1/4圈，调整焦距和亮度，旋转0.5~1圈即可看到清晰的图像（切勿用粗调焦旋钮！）如果视场亮度不合适，可用反光镜和光圈调整。

如果需要更换载玻片标本，必须逆时针转动粗调焦螺丝（不要转错方向），抬起镜筒，然后才可以取出载玻片标本。

4.光学显微镜使用技巧及注意事项：

生物显微镜是一种复杂而精密的光学仪器，由于中学阶段所学知识的局限性，对显微镜的认识比较肤浅，学习使用显微镜的方法，很大程度上是机械的、基于记忆的，方法不够全面灵活。因此，在学习使用生物显微镜进行观察时，不仅要掌握以上介绍的方法，还要在使用过程中逐渐总结、积累生物显微镜的使用技巧和注意事项，提高生物显微镜的使用技巧。下面列举一些实例，供大家参考。

（1）显微镜不宜在阳光下暴晒或使用。利用自然光进行镜检时，最好采用朝北的光源，不宜直射阳光；利用人工光时，最好采用荧光灯。

（2）拿镜子时，必须用右手握住镜臂，用左手托住镜座，切勿单手握持，以免零件脱落或与其他地方发生碰撞。

（3）小心轻放，请勿将显微镜放置于实验台边缘，应距边缘约7cm，以免跌落。

⑷ 在显微镜下检查时，身体应面向实验台，采取正确的姿势，双眼自然睁开，用左眼观察标本，用右眼观察、记录，用左手描画，调整焦距，使物体清晰，移动标本视野范围，即可描画。

⑸ 放置载玻片标本时，应对准通光孔中心，载玻片不得倒置，以免压坏载玻片或损坏物镜。

⑹ 检验液体材料时，载物台不应倾斜，以防止液体或油漏出，损坏试件，污染载物台，影响检验结果。

⑺显微镜下观察必须遵循先低倍后高倍的原则，先在低倍显微镜下找到理想的像，并移至视野中央，再换到高倍显微镜下仔细观察，寻找像时，应将标本沿一定方向移动，直至观察完整个标本，避免遗漏和重复。

⑻观察新鲜标本时，必须加盖玻片，以防止标本因蒸发而变干、变形或污染、腐蚀物镜。同时可使标本表面平整，使光线集中，有利于观察。

⑼显微镜必须随时保持清洁，不得让其粘附任何油污或灰尘。光学、照明部分只能用镜头纸擦拭，严禁用嘴吹、用手擦或用布擦；镜头部分若脏了，可用镜头纸轻轻擦拭。如有油污，先用擦镜纸蘸少许二甲苯，然后擦拭掉；机械部分用布擦拭。

⑽不要随便拔出或拆卸目镜、物镜。必须拆卸目镜时，应用干净的纱布盖住镜筒上口，防止灰尘落入镜筒内；更换物镜时，应将拆下的物镜倒置在干净的桌面上。然后放入镜头储存盒的保护盒内。

⑾显微镜使用完毕后，必须将其复原后才能放回显微镜盒内。步骤为：取出标本；转动物镜转换器，使物镜远离通光孔（若装有两个物镜，则物镜转成“八”字形）；转动粗调器，使镜筒降下。对于装有聚光镜的显微镜，应将聚光镜降下，防止物镜与聚光镜相撞。盖上丝绸盖，放回显微镜盒内。最后填写登记表。

⑿显微镜应放置在干燥的地方，以防发霉。

5.标题解释：

【例1】：光学显微镜是中学生最常用的实验仪器，如图所示，7mm和0.5mm分别代表观察清晰时物镜与物体之间的距离。请回答以下问题：

（1）如图1所示，为在观察黑藻细胞质流的实验中用显微镜物镜拍摄的。

（2）图2为光学显微镜的一组物镜，目镜上标有5×和15×，物镜上标有10×和40×。请看图回答：当要仔细观察叶绿体的形态时，显微镜的目镜和物镜上标有5×和15×的组合，应选择组合（用数字回答）。放大倍数为600倍。观察时，③、④显微视野中较亮的为宜。

（3）如果用显微镜把一个微小的物体放大50倍，这里的“放大50倍”是指这个微小的物体

A.体积 B.表面积 C.像的面积 D.像的长度或宽度

⑷ 如果在低倍显微镜下发现异物，且移动载玻片时异物不移动，但换到高倍显微镜下仍能观察到，则异物可能存在于

A. 在物镜上 B. 在目镜上 C. 在载玻片上 D. 在反射镜上

【解析】：(1)使用显微镜时，必须遵循先低倍后高倍的原则，选A。(2)要仔细观察叶绿体，需要有较高的放大倍数，这就需要高倍目镜②和高倍物镜③的组合，低倍物镜④的视野较明亮。(3)显微镜的放大倍数是指成像的长度或宽度，选D。(4)移动载玻片时，异物不动，说明异物不在载玻片上；换用高倍物镜后，仍可观察到异物，但异物不在物镜上；因此，异物只能存在于目镜上。选B。

【答案】：(1)A、(2)③、(4)D、(5)B。

【例2】：使用以下四组镜片观察洋葱根尖细胞：

（1）以视野内细胞数最多的组为组；同一光源下，以视野内光线最暗的组为组。

（2）在A组显微镜下，视野明亮，图像清晰，但换到C组显微镜后，图像模糊，此时应进行调整。

（3）观察时发现视野内有黑色异物，移动载玻片，异物不动，更换物镜后，异物仍在，然后异物在最上面。

⑷ 如果在A组中，视野内可以看到一排8个相连的细胞，则在C组中，视野内最多只能观察到几个细胞。

【解析】： （1）视野内细胞数最多，即视野最大，即放大倍数最低，故选A。 （2）A→C，即在用低倍物镜时换用高倍物镜，图像模糊，只需调节微调旋钮即可。 （3）目镜。 （4）换用高倍物镜后，视野缩小，长或宽只有原来的1/4，只能看到2个细胞

【答案】：1. 2. 微调焦螺钉。3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.